微生物实验室检测方法的验证和确认

制品微生物检验方法主要分两种类型，定性试验和定量试验。定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如无菌检查及控制菌检查。定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如微生物计数试验。

制品微生物检验方法是经过验证的，只需要按照要求进行方法适用性测试。

随着微生物学的技术发展，一些领域引人了一些新的微生物检验技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。这些方法与传统检查方法比较，简便快速或具有实时或近实时监控的潜力。

（1）微生物定性替代检验方法的验证

①专属性    微生物定性检验的专属性是检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。当替代方法以微生物生长作为判断微生物是否存在时，其专属性验证时应确认所用培养基的促生长试验，还应考虑样品的存在对检验结果的影响。当替代方法不是以微生物生长作为判断指标时，其专属性验证应确认检测系统中的外来成分不得干扰试验而影响结果，如确认样品的存在不会对检验结果造成影响。采用替代方法进行控制菌的检验，还应选择与控制菌具有类似特性的菌株作为验证对象。

②检测限    微生物定性检验的检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的特别小数量。由于微生物所具有的特殊性质，检测限是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量,而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。

检测限确定的方法是在样品中接种较低浓度的试验菌（每单位不超过5cfu)，然后分别采用药典方法和替代方法对该试验菌进行检验，以检出与否来比较两种方法的差异。试验菌接种量须根据试验而定，以接种后采用检测方法50%的样品可检出该试验菌为宜。检测限验证至少应重复进行5次。对于同一种试验菌可采用卡方检验来评价两种方法的检测限是否存在差异。

③重现性    重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。方法使用者应优先测定该验证参数。在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在检测限以上)，采用替代方法，分别由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂（或仪器)进行检验，采用卡方检验(χ²）来评价两种方法的重现性是否存在差异。验证过程中，应关注样品的一致性。

④耐用性    若替代方法检验条件较为苛刻，则应在方法中加以说明，应单独对替代方法的耐用性进行评价，以便了解方法的关键操作点。

（2）样品中微生物定量检验方法的验证

①准确度   微生物定量检验的准确度是指替代方法的检验结果与方法检验结果一致的程度，通常用微生物的回收率（%）表示。

准确度验证的方法:制备试验菌的菌悬液，菌悬液的浓度应选择为能够准确计数的较高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于10cfu/mL)。例如，菌落计数平皿法的替代方法，在制备高浓度菌悬液时其浓度是10³cfu/mL，系列稀释至10° cfu/mL。每个试验菌应至少选择5个菌浓度进行准确度确认，替代方法的检验结果不得少于方法检验结果的70%，也可以采用合适的统计学方法表明替代方法的回收率至少与方法一致。

②精密度    精密度验证的方法是:制备试验菌的菌悬液，菌悬液的浓度应选择为能够准确读数的较高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于10cfu/mL)。每个试验菌选择其中至少5个浓度的菌悬液进行检验。每一个浓度至少应进行10次重复检验，以便能够采用统计分析方法得到标准偏差或相对标准偏差。

③专属性    专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时,通过平皿法检验,能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。专属性验证时，应能够设计出可能使替代方法出现假阳性的实验模型来挑战替代方法。当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时（如不需要增菌或在1～50cfn节围内就可直接测定的的定量方法)，以上验证方式就显得更为重要。中净环球净化可提供洁净厂房、GMP车间、生物实验室的咨询、规划、设计、施工、安装改造等配套服务。

④定量限    定量限验证的方法是:在检验范围的低限制备5份不同含菌浓度的菌悬液，每份菌悬液分别用药典方法和替代方法进行不少于5次检验，采用统计方法比较替代方法的检验结果与药典方法结果的差异，从而评价替代方法的定量限。

⑤线性和范围    线性验证时须覆盖能够准确测定的所有浓度范围。每株试验菌应选择至少5个浓度，每个浓度至少测定5次。根据以上实验数据，以检验结果为因变量，以样品中微生物的预期数量为自变量进行线性回归分析，计算相关系数r。替代方法的相关系数不得低于0.95。

微生物定量检验的范围是指能够达到一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的高低限浓度或数量的区间。

⑥重现性    在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在定量限以上)，采用药典方法和替代方法，分别由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂（或仪器)进行检验，对检验结果进行统计分析，以相对标准偏差（RSD)来评价两种方法的重现性差异。

⑦耐用性    替代方法与药典方法的耐用性比较不是必需的，但应单独对替代方法的耐用性进行评价,以便了解方法的关键操作点。

（3）检验方法活用性

使用药典方法进行产品无菌检查时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。

薄膜过滤法是取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度下培养，培养时间不得超过5天，其他各试验菌同法操作。

直接接种法是取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接入小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培养,培养时间不得超过5天。

结果与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应消除供试品的抑菌作用,并重新进行方法适用性试验。

（4）非无菌产品微生物限度检查

计数方法验证的原理主要是确认样品有无抑菌性，即确认检验样品中的微生物能否在此培养基中正常生长。通常方法是在检验样品中加入代表类型的菌种（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉，加菌量应不大于100cfu)，各试验菌应逐一进行验证试验。如果供试品对微生物生长具有抑制作用则需要采用适当方法消除抑制作用。

（5）控制菌检查方法适用性

控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物，应根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株。

按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中;采用薄膜过滤法时,取规定量供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤后，注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。依相应的控制菌检查方法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。如果上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查;若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性并重新进行方法适用性试验。

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