GMP实验室工程理化分析方法验证和确认

（1）适用范围

以下内容适用于化学制品、生物制品（包括物料和产品）的理化分析方法。

（2）哪些分析方法需要验证和确认?

原则上各类方法均需进行验证，依照方法来源和适用范围的不同，验证的要求有所不同。标准方法通常认为在被确定为标准方法前已经过验证，使用者在首次采用此类方法前只需进行确认来证明实际使用条件下方法的适用性。

需要进行验证或确认的分析方法包括:鉴别，杂质定量以及限度测试，物料和产品有效成分含量测定，制剂中其他成分（如防腐剂等，添加剂等）的定量测试，溶出度，释放度的溶出量测试。此外一些物理参数的测试（例如粒径分布、旋光度等)方法也需要进行适当程度的验证。

（3）方法验证性能参数的选择

方法验证参数的选择应基于方法类型和实际应用环境，并非总要对所有的分析性能参数进行验证。

（4）方法确认性能参数的选择

分析方法确认是指已经验证过的方法在实际使用条件下的适用性的确认试验。对于实验室基本的、已成为日常操作的法定测试方法不需要进行确认，除非有现象表明法定测试方法不适用于被测的物质。

不同的监管机构对于方法确认的技术要求略有差别,使用者应针对不同监管机构的技术要求，通过对分析方法类别、产品属性以及方法使用过程中可能出现的风险的定义和识别来选择方法确认活动的具体验证参数，不限制对参数的适当的加严或放宽。

（5）性能参数的验证

方法验证试验中各个参数的测试顺序没有官方的指南，优选顺序取决于方法本身。建议耗时很长或者需要替换试验条件的参数测试一般放在后面执行，如方法耐用性。适用时某些参数可以合并在一起试验，如精密度和准确度测试。

①专属性    专属性定义为“当预料到一些组分可能存在时，准确无误地检测被分析物的能力。通常这些可能存在的组分有杂质、降解产物、基质等”。专属性的研究一般优先于其他验证项目，为方法首要的属性,鉴别反应、杂质检查、含量测定方法应考察其专属性。一种方法不够专属，可由其他分析方法予以补充。

a.鉴别    鉴别试验应证明被分析物符合其特征，专属性试验要求证明能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，通常通过含被分析物的样品呈正反应，而不含被分析物的样品呈负反应，结构相似或组分中的有关化合物也应呈负反应的途径来证明。

b.杂质检查    在可获得杂质情况下，可向供试品中加入一定量的杂质，证明杂质与共存物质能得到分离和检出。在不能获得杂质或降解产物情况下，专属性可通过与另一种已证明合理但分离或检测原理不同，或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确定。或将供试品用强光照射、高温、高湿、酸（碱）水解及氧化的方法进行破坏，比较破坏前后检出的杂质个数和量。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测。

c.含量测定    在可获得杂质情况下，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料的试样比较测定结果。

在不能获得杂质情况下，可采用另一个经验证方法进行比较，对比两种方法测定的结果。也可采用破坏性试验[强光照射、高温、高湿、酸（碱)水解及氧化]，得到含有杂质或降解产物的试样，用两种方法进行含量测定比较测定结果。必要时进行色谱峰纯度检查，证明含量测定成分的谱峰中不包含其他成分。

②精密度    精密度系指在规定的条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

精密度可以在以下三个层面考虑:重复性、中间精密度和重现性。在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性;在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定所得结果之间的精密度，称为中间精密度;在不同实验室由不同分析人员测定所得结果之间的精密度，称为重现性。

a.重复性    在进行重复性验证时，要求待测组分浓度在100%时重复测量至少6次或覆盖整个规定浓度范围并重复测量至少9次。例如，可以在三个不同浓度分别进样三次。

b.中间精密度    中间精密度通过比较同一实验室数日内各次检测的结果计算而得。方法的中间精密度可以反映以下因素引起的结果差异:不同的操作人员;不一致的操作时间;不同的仪器;不同供应商的标准品和试剂;不同批次的色谱柱;综合因素。

中间精密度验证的目的是证实方法在同一个实验室内运行能够得到相同的结果。

c.重现性    重现性的目的是证实分析方法在不同实验室运行能够得到相同的结果。分析方法的重现性是通过不同实验室的不同分析人员对均匀样品分析的结果计算而得的。重现性的验证对于在不同实验室使用的方法来说非常重要。

d.精密度数据要求    精密度验证均应报告偏差、标准偏差、相对标准偏差或置信区间。在基质复杂、含量低干0.01%及多成分等分析中，精密度接受范围可适当放宽。

③准确度    准确度足义为测定值与真实值或认可的参考值之间接近的程度。准确度也可以定义为方法的测定值与真实值接近的程度。

准确度为定量测定的必要条件，因此涉及定量测定的检测项目均需要验证准确度，如含量测定、杂质定量试验等。准确度试验浓度应能覆盖整个考虑范围，并且应包含接近定量限的浓度点，浓度范围的中间值,还有校正曲线的最高点。

a.含量测定

制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物讲行测定，必要时，与另一个已建立准确度的方法比较结果。中净环球净化可提供无尘车间、洁净车间、净化车间的咨询、规划、设计、施工、安装改造等配套服务。

b.杂质定量试验    杂质的定量试验可向制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质，可用本法测定结果与另一成孰的方法进行比较，如经过验证的方法。

如不能测得杂质的相对响应因子，可在线测定杂质的相关数据，如采用二极管阵列检测器测定紫外光谱，当杂质的光谱与主成分的光谱相似，则可采用原料制品的响应因子近似计算杂质含量（自身对照法）。并应明确单个杂质和杂质总量相当于主成分的质量比(%)或是面积比(%)。

c.化学成分测定方法的准确度    可用对照品进行加样回收率测定,即向已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品计算回收率。在加样回收试验中需注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之和须在标准曲线线性范围之内。

d.校正因子的准确度    本文中的校正因子是指气相色谱法和高效液相色谱法中的相对重量校正因子。绝对（或定量）校正因子是指单位面积的色谱峰代表的待测物质的量,待测定物质与所选定的参照物质的绝对校正因子之比,即为相对校正因子。

相对校正因子可采用替代物（对照品）和被替代物（待测物）标准曲线斜率比值进行比较获得;采用紫外吸收检测器时，可将替代物（对照品）和被替代物（待测物）在规定波长和溶剂条件下的吸收系数比值进行比较，计算获得。

e.准确度数据要求    在规定范围内,取同一浓度（相当于100%浓度水平）的供试品，至少测定6份样品的结果进行评价;或设计3种不同浓度，每种浓度分别制备3份供试品溶液，用9份样品的测定结果进行评价。化学制品应报告已知加入量的回收率（%)，或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或置信区间（置信度一般为95%)；制品应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率（%）计算值，以及回收率（%）的相对标准偏差（RSD)或置信区间。校正因子应报告测定方法、测定结果和RSD。

④线性    线性系指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物浓度呈比例关系的程度。

线性可以直接用待测物质测定（通过稀释标准贮备液）或分别称取待测品种的各组分后合成混合物。配制5个以上不同浓度的标准溶液（浓度范围至少在期望浓度的80%～120%之间)，用试验结果计算线性。响应值应与被分析物的浓度成直接的比例关系，或通过定义明确的数学计算形成比例关系。用于结果计算的线性回归方程其截距不得明显偏离零点。如果得到一个显著的非零截距,应证明其对方法准确度无影响。

应报告线性曲线的相关系数、y轴截距、回归线斜率和残差平方和。报告中还应包括数据图。

⑤范围     范围系指分析方法能达到一定精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间。分析方法的范围一般用与检测结果相同的单位表述（例如，百分比)。对于含量测定，要求的小范围是检测浓度的80%～120%。杂质的范围扩展为定量限到每种杂质规定限度的120%,或杂质规定限度的50%～120%。

⑥检测限和定量限  

检测限常常与方法的灵敏度相混淆，灵敏度是以响应值对被分析物的浓度或质量作图所得校正曲线的斜率。

定量限和检测限测定方式列举如下。

a.视觉判断    通过测定待测成分浓度已知的样品，并确定该成分能被可靠检出的低水平来计算检测限。

b.信噪比法    通过比较测得的已知低浓度的样品信号和空白样品的信号，建立能够监测的被测物的低浓度所得到的方法。

c.基于空白的响应值标准偏差    通过分析适当数量的空白样品并计算所得响应值的标准偏差来测量分析背景响应值的大小。

检测限数据须用含量相近的样品进行验证。应附测定图谱，说明试验过程和检测限结果;定量限数据还应包括准确度和精密度验证数据。

⑦耐用性    耐用性系指在测定条件有小的变动时,测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于日常检验提供依据。

确定方法的耐用性时，使一系列的方法参数在一定的范围内变动，测定这些变动对结果的量化影响。如果参数的影响在预先设定的允许范围内,则证实方法在该参数范围内耐用。

耐用性试验可以确定分析方法的关键参数及其允许的容量范围，并可以帮助评估一种或某种参数变化后方法是否需要重新验证。在方法开发阶段应考虑通过评估的方式确定耐用性试验因素设计，这也是“质量源于设计”（QbD)在方法开发中的体现。

⑧稳定性    稳定性试验对于计算从样品采集到样品分析之间的允许时间非常重要，避免在制备样品溶液、提取、净化、相转移或样品瓶的贮存（在冰箱或在自动进样器里）过程中化学化合物在分析前发生降解。

用于稳定性试验的条件应反映实际样品在处理、贮存和分析时遇到的各种情况。通过比较放置周期内的溶液与新鲜制备溶液的仪器响应值来检测稳定性，通过样品溶液的重复测试,计算测得值的RSD来确定溶液稳定性。

（6）分析方法日常质量控制计划的制定

分析方法验证的目的不仅是在开始使用方法时保证分析数据的有效性，还要在方法的整个使用周期内都确保其有效性。为了证实方法和系统的性能在样品分析时与开始规定的相同,应在常规的样品分析中纳入适当的检查手段。

本文由中净环球净化CCG(www.ccg-sz.com)提供，转载请注明出处。